新型コロナウイルス感染症(COVID-19)で話題のRCR検査の仕組みとゲノム編集技術を応用した新たな検査法をゆるふわな感じで説明してみた話。

目次。

 

 

はじめに。

新型コロナウイルス感染症で緊急事態宣言が出た影響で、研究室に入れなくなったので、ひたすら株式自動売買プログラムの開発を進めているsun_ek2です。

 

そして最近は、ずっと株式自動売買プログラム開発関連、すなわちプログラミングをネタにした文章を書いていますが、一応、僕の専門は生物系で、PCR検査っぽいこと(RT-qPCR)を数えきれないくらいやってきたので、一般の人に向けて新型コロナウイルスの検査関連の文章を書きます。

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新型コロナウイルス関連で文章を書こうと思った直接のきっかけは、Twitterで以下のTweetが回ってきたことです。

 

このTweetでは、新型コロナウイルスを検出する新たな検査法に関する論文を紹介しています。この論文内では、従来のPCR検査(RT-qPCR)と新たな検査手法を対比している場面が多々あり、また最近は、一般社会でも「PCR検査」という言葉を聞く機会が増えたと思うので、ここでは、この論文の紹介だけではなく、ついでにPCR検査(RT-qPCR)の仕組みの話もします。

 

以前にも新型コロナウイルス関連で文章を書いたのでこちらもよければどうぞ。

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ウイルスって?

ヒトの細胞や細菌とウイルスの違いは、ざっくり言うと自分一人で増殖することができるか否か。

 

ヒトや細菌といった生物の細胞の中には、DNAと呼ばれる遺伝情報を保存する分子が存在している。生物は、DNAの遺伝情報をRNAという分子に写し取り、遺伝情報が写し取られたRNAの情報を元にタンパク質を作る。そして作られたタンパク質は、細胞の部品になったり、細胞の生命活動を維持するためのナノマシンとしてはたらいたりする。また細胞分裂する際には、タンパク質を使って遺伝情報が保存されたDNAをコピーする。

 

ちなみにDNAの情報を元にRNAを作ることを転写、RNAの情報を元にタンパク質を作ることを翻訳という。そして転写という言葉は、PCR検査の仕組みの話で少し出てくる。

 

ウイルスの場合、自身の遺伝情報をDNA、もしくはRNAに保存している。巷でよく耳にするインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、そして現在、パンデミックを引き起こしている新型コロナウイルス(CODIV-19)は、DNAではなくRNAに自身の遺伝情報を保存している。

 

ウイルスもヒトや細菌などと同様に遺伝情報を持っているが、自分一人だけだとタンパク質も作れないし、遺伝情報を保存しているRNAのコピーもできないので、増殖することができない。

 

しかし、ウイルスは、ヒトの細胞などに不法侵入(感染)することができる。ウイルスは、ヒトの細胞に感染して、ヒトの細胞のタンパク質を作るシステムを不正に利用して、ウイルスに必要なタンパク質を作る。その中には、RNAをコピーするタンパク質もあり、ウイルスは、ヒトの細胞の中の資源を盗んで、タンパク質に加え、自身のRNAもどんどん作る。そして、ヒトの細胞の中で作られたウイルスのタンパク質とRNAが組み合わさって新たなウイルス粒子ができ、最終的には、ヒトの細胞の膜を突き破って、外に出ていき、別の細胞に感染して、さらにウイルス粒子を増やす。

 

 

 

 

PCR検査(RT-qPCR)って?

PCRは、Polymerase Chain Reactionの略で、DNAを増やす技術のこと。Polymeraseは、DNAをコピー(複製)するタンパク質のこと。PCRを使い、DNA複製反応を連鎖的に行うことによって、少ない量のDNAから大量のDNAを作り出すことができる。生物系の研究にはなくてはならない技術で、PCRを開発した人は、ノーベル生理学賞を取っていたと思う。DNA鑑定なんかにも使われる。

 

PCR検査では、まず初めに患者の鼻や口の奥から粘液からRNAを精製する。RNA精製は、専用のキットがあって、普通に売られている。新型コロナウイルスは、自身の遺伝情報をRNAに保存しているので、もし患者がコロナに感染していたとすると、精製したRNAの中には、新型コロナウイルス由来のRNAも含まれている。

 

その後、精製したRNA溶液からDNAを作る。DNAの情報を元にRNAを作ることを「転写」というが、今回はRNAの情報を元にDNAを作るので「転写」ではなく「逆転写」と呼ばれる。英語では、Reverse Transcriptionと呼ばれ、略してRT、PCR検査(RT-qPCR)のRTにあたる。

 

逆転写が終われば、新型コロナウイルスの遺伝情報が保存されたDNAとヒト由来のRNAから作られたDNAが混ざった溶液が得られる。

 

このままでは、ヒト由来のDNAと新型コロナウイルス由来のDNAが混ざっているし、そもそも新型コロナウイルス由来のDNAの量が少なすぎて、上手く検出することができない。そのため、次はヒト由来のDNAを増やさずに新型コロナウイルス由来のDNAを検出できる量まで増やさないといけない。そこで登場するのがPCR。

 

PCRを知るためには、まずDNA複製について知らなければいけない。昔、詳しく説明したのでよければどうぞ。

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DNAは二重らせん構造をとっている。DNA複製タンパク質(Polymerase)は、その二重らせんの一方の情報を読み取りながら、その情報に対応する新たなDNA鎖を作る。

 

しかし、DNA複製タンパク質は、何もない状態からDNAを複製することはできない。まず初めにプライマーと呼ばれる短いRNA断片が複製の始点にくっつかないといけない。DNA複製タンパク質は、一方のDNAの情報を読み取りながらプライマーの尻尾からどんどんとDNAの鎖を伸ばして、複製を進めていく。(PCRではDNAをプライマーとして使う)

 

短いRNA・DNA断片であるプライマーは、複製されるDNAにくっつく。プライマーがくっつくことによって、DNA複製が始まる。そして、プライマーは、自身と相補な配列にくっつく。DNAは、A、T、G、Cという4つの文字の列で表される。Aと相補的なのはT、Gと相補的なのはCである。そして、AAAと相補的なのはTTT、GGGと相補的なのはCCCである。

 

仮に新型コロナウイルス由来のDNAの配列が

…(略1)…AAA…(略2)…GGG …(略3)…

だったとする。そして、AAAとTTTの並び方はヒト由来のDNAには存在しないとする。

 

ヒト由来のDNAと新型コロナウイルス由来のDNAが混ざった溶液にDNA複製タンパク質とCCCとAAAというプライマーを入れると、新型コロナウイルス由来のDNAのGGGのところにプライマーCCCがくっつく。ヒト由来のDNAには、AAAもGGGもないので、プライマーはくっつかず、ヒト由来のDNA複製反応は起こらない。

 

新型コロナウイルス由来のDNAの配列にプライマーCCCがくっついて、DNA複製反応が起こると、次のようなDNAができる。

…【略1】…TTT…【略2】…CCC

その後、このDNAのTTTにプライマーAAAがくっついて、DNA複製反応が起こると、次のようなDNAができる。

AAA…(略2)…GGG

その後、このDNAのGGGにプライマーCCCがくっついて、DNA複製反応が起こると、次のようなDNAができる。

TTT…【略2】…CCC

 

この反応が連鎖的に起こり、新型コロナウイルス由来のDNA断片AAA…(略2)…GGGとそれに相補的なDNA断片TTT…【略2】…CCCが指数的に増幅される。DNA複製タンパク質(Polymerase)が連鎖的に複製反応(Chain Reaction)を起こすので、この反応はPolymerase Chain Reaction、略してPCRと呼ばれる。

 

最初に新型コロナウイルス由来のDNAがたくさんあれば、早い段階でDNAは一気に増幅され、少なければ遅い段階でDNAは増幅される。この「DNAが一気に増幅されるタイミング」を使えば、もともと溶液に新型コロナウイルス由来のRNAがどれだけ入っていたかわかる。PCRを使えば、RNA・DNAの量を測る、つまり定量することができる。「定量的な」は英語でquantitative。RT-qPCRのqの部分にあたる。

 

ちなみにDNAが一気に増えるタイミングは、DNAの鎖に挟まる蛍光分子を使って測る。DNAがあんまりないときにこの分子に光を当て、エネルギーを注入すると、この分子は振動することによって、エネルギーを捨てる。けれども、DNAがたくさんあり、DNAの鎖にこの分子が挟まると、振動することができないので、この分子は振動の代わりに光(蛍光)を出して、エネルギーを処分する。この光を測れば、DNAが一気に増えるタイミングがわかる。

 

一通り、PCR検査(RT-qPCR)の話が終わったので、ここからはPCR検査に代わるかもしれないゲノム編集技術を応用した新たな新型コロナウイルスの検査方法の話。

 

これから紹介する論文は、オープンアクセスといって、無料で誰でも読める論文なので興味のある人は、ぜひどうぞ。

 

 

 

 

CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2

www.nature.com

 

著者・掲載誌。

James P. Broughton, Xianding Deng, Guixia Yu, Clare L. Fasching, Venice Servellita, Jasmeet Singh, Xin Miao, Jessica A. Streithorst, Andrea Granados, Alicia Sotomayor-Gonzalez, Kelsey Zorn, Allan Gopez, Elaine Hsu, Wei Gu, Steve Miller, Chao-Yang Pan, Hugo Guevara, Debra A. Wadford, Janice S. Chen & Charles Y. Chiu

Nature Biotechnology, 2020

 

 

ゲノム編集技術 CRISPR–Cas12って?

ゲノム編集技術の最初は、CRISPR–Cas9でCRISPR–Cas12はその後続だと思う(多分)。調べてみた感じ、細かい部分は違うがおおよそCRISPR–Cas9とCRISPR–Cas12は同じ。

 

昔、CRISPR–Cas9の開発者の1人であるJennifer Doudna博士がCRISPR–Cas9の仕組みを一般の人にプレゼンしているTEDの動画を紹介したので、よければどうぞ。日本語字幕があるので、英語が分からなくても大丈夫。

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元々、このシステムは細菌がウイルスから自分を守るための武器(免疫系)である。ウイルスが細菌に侵入すると、細菌は、ウイルスのDNAに相補的なRNA断片を作り、そのRNA断片はウイルスのDNAにくっつく。その後、Casタンパク質がそのDNAを認識して、切断する。切断されたウイルスのDNAは、もう使い物にはならないので、ウイルスは細菌の内部で悪さをすることができない。ちなみにウイルスのDNAに相補的なRNA断片の情報は、CRISPRと呼ばれる細菌のDNAのある領域に保存されている。先祖を含め、一度、戦ったウイルスの情報の断片は、CRISPRに保存されているので、そのウイルスに再び侵入されても、その情報を元に速やかにウイルスのDNAをRNA断片で発見し、切り刻むことができる。

 

DNAを切り刻むためには、切り刻みたい領域に相補的なRNAが必要である。逆に言うと、編集したいDNA領域に相補的なRNA(guide RNA、略してgRNA)を人工合成して、外から入れれば、実際にDNAをピンポイントでいじくることができる。

 

そして、gRNAを新型コロナウイルスのRNAから作ったDNAに相補になるように設計すると、患者が新型コロナウイルスに感染しているか、感染していないか、検査することができるというのが今回の論文。

 

 

 

 

RT-LAMP法って?

LAMP法は、PCRと同様にDNAを増幅する技術。Loop-Mediated Isothermal Amplificationの略。先ほどは、説明を省いてしまったが、PCRによってDNAを増やすためには、反応溶液の温度を一定のリズムで変えなければいけない。DNAは、二重らせん構造を取っている。先ほど説明したプライマーをDNAにくっつけるためには、温度を上げて、この二重らせんをほどかないといけない。二重らせんをほどいた後にプライマーがくっつくように温度を下げて、プライマーがくっついた後にDNA複製タンパク質がちゃんとはたらいてくれるように反応溶液を温める。このサイクルをぐるぐる回す。

 

LAMP法は、PCRとは違い、温度を変えずにDNAを増やすことができる。LAMPのI、Isothermalは温度一定という意味である。そもそも、DNA複製タンパク質は、DNAが二重らせん構造を取っていても、それを自力でほどいて、DNAを伸ばすことができる。しかし、DNA複製に必要なプライマーは、DNAが二重らせん構造を取っているとくっつくことができない。PCRでは、温度を上げて、二重らせん構造をほどいて、この問題を解決していたが、LAMPでは、プライマーがくっつく領域が常に二重らせんを取らず、投げ縄のようなループ構造を取るようにあらかじめ増幅したいDNAの両端に細工することで、この問題を解決する。ループ構造になるように細工がLAMPのL、M、Loop-Mediatedに対応する。

 

言葉で説明するのは難しいので、以下のサイトの図を見れば、雰囲気が分かると思う。

loopamp.eiken.co.jp

 

普通は2本のDNAで二重らせんを形成するが、DNAの端っこに細工をすれば、1本のDNAの端っこが部分的に二重らせんを形成して、ダンベルのような形になる。プライマーは、ダンベルの膨らんだ部分にくっつくことができるので、わざわざ温度を上げる必要はない。

 

先ほど言ったように新型コロナウイルスは、自身の遺伝情報をRNAに保存しているので、逆転写(RT)によって、LAMPの前にRNAをDNAにする必要がある。その段階で、DNAの両端がダンベルのような形になるように(分子内で部分的に二重らせんを形成するように)細工を仕掛ける。

 

 

 

 

LbCas12a trans-cleavage

今回使われたCasタンパク質は、Lachnospiraceae bacteriumというバクテリア由来のLbCas12a。LbCas12aとRT-LAMPで増幅した新型コロナウイルス由来のDNAとそのDNAと相補なRNA断片(gRNA)を混ぜると、gRNAが新型コロナウイルス由来のDNAにくっついて、LbCas12aがそのDNAを認識し、切断する。

 

この話は、先ほど説明したゲノム編集の話と同じであるが、この検査法のミソは、ここから。LbCas12aとgRNAと新型コロナ由来のDNAが複合体を形成すると、LbCas12aは、新型コロナウイルス由来のDNAのみならず、近くにある二重らせんを形成していないDNA(一本鎖DNA)を無差別に切り刻む。この無差別にDNAを切り刻むことをtrans-cleavageと言うらしい。

www.ncbi.nlm.nih.gov

 

先ほどの溶液の中には、LbCas12aとgRNAと新型コロナウイルス由来のDNAに加えて、無差別に切り刻まれる一本鎖DNAが入っている。このDNAには細工がしてあって、端っこにビオチンという分子が、他方の端っこにFAMという分子が繋がれている。このDNA自体は、新型コロナ由来のDNAと相補的ではなく、何の関係もないが、LbCas12aとgRNAと新型コロナウイルス由来のDNAが複合体を形成すると、無残にも切り刻まれてしまう。切り刻まれてしまうと、DNAは、ビオチンがくっついた断片とFAMがくっついた断片に分かれる。

 

 

 

 

Lateral flow strip (Milenia HybriDetect 1, TwistDx)

先ほどのサンプルをLateral flow stripというガラスの小さなチップに垂らすと、毛細管現象によって液が徐々に移動する。コップに水を入れて、ティッシュペーパーを少し浸すと、徐々に液が吸い上がってくるのと同じである。しばらくすると、先ほどのサンプルは、ビオチンを吸着する分子(抗体)が並んだ領域を通過する。もし患者が新型コロナウイルスに感染していなければ、trans-cleavageは起こっていないので、ビオチンとFAMの両方がくっついたDNAがそこで吸着される。もし患者が新型コロナウイルスに感染していれば、trans-cleavageが起こっているので、ビオチンとDNA断片が吸着され、残りのDNA断片とFAMはそのまま流れていく。

 

実は、先ほどのサンプルにはFAMにくっつく分子(抗体)と金ナノ粒子を繋げたものが混ぜられている。もし、ビオチンとFAMの両方がくっついたDNAが吸着されていれば、金ナノ粒子がFAMにくっつく。FAMは蛍光分子で金ナノ粒子はその蛍光を増強する。そのため、新型コロナウイルスに感染していなければ、そこから蛍光を発しているのを観察できる(目視で見えるらしい)。一方で、ビオチンしかつながっていないDNAが吸着していれば(新型コロナウイルスに感染していれば)、蛍光を発するFAMもそれを増強する金ナノ粒子も、その領域には留まってくれないので、蛍光は見えない。

 

 

 

 

まとめると。

新型コロナウイルスに感染している患者から取ったサンプル内のRNAをRT-LAMPによって、増幅するとヒト由来のDNAと新型コロナ由来のDNAの混ざりものが得られる。その中にLbCas12a、gRNA、ビオチンとFAMが繋がったDNAを加えると、LbCas12aとgRNAと新型コロナ由来のDNAの複合体ができて、LbCas12aがビオチンとFAMが繋がったDNAを無差別に切断する。最後にそのサンプルをLateral flow stripに流すと、ビオチンだけが吸着されるので、蛍光は見えない。

 

一方で、新型コロナウイルスに感染していない患者から取ったサンプルだと、trans-cleavageは起こらず、ビオチンとFAMはつながっているので、ビオチンを吸着する領域にFAMも留まり、さらにFAMに金ナノ粒子がくっついて、強い蛍光がみられる。

 

この検査法は、DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter (RT–LAMP/Cas12)、略してDETECTR (RT–LAMP/Cas12)と名付けられている。

 

 

 

 

従来手法:PCR検査  (RT-qPCR) vs 提案手法:DETECTR (RT–LAMP/Cas12)

測定限界。

  • PCR検査 (RT-qPCR) …1 µlの溶液に1分子の新型コロナウイルスのRNAがあれば、なんとか検出できる。
  • DETECTR (RT–LAMP/Cas12) …1 µlの溶液に10分子の新型コロナウイルスのRNAがあれば、なんとか検出できる。

勝者、従来手法:PCR検査(RT-qPCR)。

 

 

結果が分かるまでにかかる時間。

  • PCR検査 (RT-qPCR) …約4時間。
  • DETECTR (RT–LAMP/Cas12) …約45分。

勝者、提案手法:DETECTR (RT–LAMP/Cas12)。

 

 

結果の定量性。

  • PCR検査 (RT-qPCR) …定量的。新型コロナウイルスのRNAがサンプルにどのくらい含まれているか分かる。
  • DETECTR (RT–LAMP/Cas12) …定性的。新型コロナウイルスのRNAがサンプルあるか、ないかしか分からない。(どのくらい含まれているかは分からない)

勝者、従来手法:PCR検査(RT-qPCR)。

 

 

必要な装置。

  • PCR検査 (RT-qPCR) …専用の装置が必要。と言っても、装置の大きさは、1人か2人で運べるくらい(実際に研究室の模様替えの時に運んだことがある)。
  •  DETECTR (RT–LAMP/Cas12) …大がかりな装置は不要。

勝者、提案手法:DETECTR (RT–LAMP/Cas12)。

 

PCR検査に必要な装置は、研究施設にしかなく、患者からサンプルを取って、研究施設に送って、結果が出るまでに1日以上かかる。一方で、DETECTR (RT–LAMP/Cas12) による検査には、専用の装置は必要なく、結果もすぐ出るので、新型コロナウイルスによるパンデミックに伴う検査の需要に応えられるかもしれない。

 

 

 

 

最後に。

とまあ、こんな感じでPCR検査の仕組みとゲノム編集技術を利用した新たな検査法の論文を紹介しました。この文章を読んだ方は、ニュースとかでPCR検査という言葉が出てきたら、少しだけ親近感が湧くかもしれません。

 

新型コロナウイルスによるパンデミックの影響によって、外出自粛になったり、自分が勤めている会社が倒産の危機に陥ったり、多くの人が感染して亡くなったりと世界全体が暗いニュースで覆われているように感じます。こんな惨状を「コロナ禍」というらしいですね。最近、知りました。

 

「コロナ禍」をネガティブにとらえる人が多いですが、僕は、ものすごいチャンスだと思っています。革命的で世界がひっくり返るような出来事です。この革命に上手く乗ることができれば、社会の底辺にいる人でも成り上がることができるかもしれません。

 

言うまでもありませんが、パンデミックが終わっても「コロナ禍」は終わりません。パンデミック後でも、その影響を引きずって、多くの会社が潰れ、多くの人が失業し、多くの人が自殺すると思います。まさに「コロナ禍」です。

 

今は、パンデミック中の「コロナ禍」によって、外に出られず、働けず、いつもよりも時間がたくさんあると思います。そんな中、朝から晩まで、ネットコンテンツやゲームで時間を浪費するのは、危険ではないかと思っています。それは、単に現実逃避であって、ネットコンテンツやゲームに時間を費やしている間、あなたのお金と時間は、コンテンツやゲームを作った人たちに吸い取られ続けていきます。あなたが今、社会の底辺にいるのであれば、そのままだとパンデミック後の「コロナ禍」によって、更に社会の底辺に落ちていくことでしょう。あなたは、ひたすらお金と時間を吸い上げられ続けるのです。

 

一方で、パンデミック中の「コロナ禍」によって生まれた時間は、パンデミック後の「コロナ禍」が渦巻く世界で生き残るための準備をする絶好の機会です。今は、しっかり準備して、パンデミック後の「コロナ禍」で社会の底辺から成り上がりましょう。

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なんてことを思いながら、僕はひらすら株式自動売買プログラム開発をしたり、論文を読んだりする日々です。

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